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建立诱导型 CRISPRd 系统以阻断人多能干细胞中转录因子结合位点的方案。

Protocol for establishing inducible CRISPRd system for blocking transcription factor-binding sites in human pluripotent stem cells.

机构信息

Division of Developmental Biology, Center for Stem Cell & Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, OH 45229, USA.

Division of Developmental Biology, Center for Stem Cell & Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati, Cincinnati, OH 45229, USA.

出版信息

STAR Protoc. 2024 Sep 20;5(3):103233. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103233. Epub 2024 Aug 11.

DOI:10.1016/j.xpro.2024.103233
PMID:39133612
原文链接:https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11357809/
Abstract

Transcription factor (TF) gene knockout or knockdown experiments provide comprehensive downstream effects on gene regulation. However, distinguishing primary direct effects from secondary effects remains challenging. To assess the direct effect of TF binding events, we present a protocol for establishing a doxycycline (Dox)-inducible CRISPRd system in human pluripotent stem cells (hPSCs). We describe the steps for establishing CRISPRd host hPSCs, designing and preparing single-guide RNA (sgRNA) expression lentivirus vectors, generating CRISPRd hPSCs transduced with sgRNAs, and analyzing CRISPRd TF-block effects by chromatin immunoprecipitation (ChIP)-qPCR. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Matsui et al..

摘要

转录因子 (TF) 基因敲除或敲低实验为基因调控提供了全面的下游效应。然而，区分主要的直接效应和次要效应仍然具有挑战性。为了评估 TF 结合事件的直接效应，我们提出了一种在人多能干细胞 (hPSC) 中建立强力霉素 (Dox) 诱导的 CRISPRd 系统的方案。我们描述了建立 CRISPRd 宿主 hPSC、设计和准备单指导 RNA (sgRNA) 表达慢病毒载体、生成转导 sgRNA 的 CRISPRd hPSC 以及通过染色质免疫沉淀 (ChIP)-qPCR 分析 CRISPRd TF 阻断效应的步骤。有关此方案的使用和执行的完整详细信息，请参阅 Matsui 等人的研究。

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引用本文的文献

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