• 文献检索
  • 文档翻译
  • 深度研究
  • 学术资讯
  • Suppr Zotero 插件Zotero 插件
  • 邀请有礼
  • 套餐&价格
  • 历史记录
应用&插件
Suppr Zotero 插件Zotero 插件浏览器插件Mac 客户端Windows 客户端微信小程序
定价
高级版会员购买积分包购买API积分包
服务
文献检索文档翻译深度研究API 文档MCP 服务
关于我们
关于 Suppr公司介绍联系我们用户协议隐私条款
关注我们

Suppr 超能文献

核心技术专利：CN118964589B侵权必究
粤ICP备2023148730 号-1Suppr @ 2026

文献检索

告别复杂PubMed语法，用中文像聊天一样搜索，搜遍4000万医学文献。AI智能推荐，让科研检索更轻松。

立即免费搜索

文件翻译

保留排版，准确专业，支持PDF/Word/PPT等文件格式，支持 12+语言互译。

免费翻译文档

深度研究

AI帮你快速写综述，25分钟生成高质量综述，智能提取关键信息，辅助科研写作。

立即免费体验

通过分选固定细胞基因组DNA的衍生CRISPR-Cas9文库对整合的sgRNA进行迭代富集的方案。

Protocol for iterative enrichment of integrated sgRNAs via derivative CRISPR-Cas9 libraries from genomic DNA of sorted fixed cells.

作者信息

Ordóñez Adriana, Ron David, Harding Heather P

机构信息

Cambridge Institute for Medical Research (CIMR), University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, The Keith Peters Building, Cambridge CB2 0XY, UK; Universidad Católica de Murcia (UCAM), UCAM HiTech, Campus de los Jerónimos 135, Guadalupe E-30107, Spain.

Cambridge Institute for Medical Research (CIMR), University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, The Keith Peters Building, Cambridge CB2 0XY, UK.

出版信息

STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103493. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103493. Epub 2024 Dec 10.

DOI:10.1016/j.xpro.2024.103493
PMID:39661507
原文链接:https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11697544/
Abstract

Here, we present a protocol for iterative enrichment of integrated single guide RNA (sgRNA) via derivative CRISPR-Cas9 from genomic DNA (gDNA) of phenotypically sorted fixed cells. We describe steps for high-scale lentiviral production, genome-wide screening, extracting gDNA from fixed cells, cloning of integrated sgRNAs, and high-scale transformation. This protocol introduces three key advantages: (1) applicability to fixed cells, (2) bypassing epigenetic drift, and (3) pause points lowering the contamination risk. We believe this approach will benefit researchers applying somatic cell genetics in cell biology. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Ordoñez et al..

摘要

在此，我们展示了一种通过从经表型分选的固定细胞的基因组DNA（gDNA）衍生的CRISPR-Cas9对整合的单向导RNA（sgRNA）进行迭代富集的方案。我们描述了大规模慢病毒生产、全基因组筛选、从固定细胞中提取gDNA、整合sgRNA的克隆以及大规模转化的步骤。该方案具有三个关键优势：（1）适用于固定细胞；（2）绕过表观遗传漂变；（3）设置了降低污染风险的暂停点。我们相信这种方法将使在细胞生物学中应用体细胞遗传学的研究人员受益。有关本方案使用和实施的完整详细信息，请参阅奥尔多涅斯等人的研究。

https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/1d8a4c0af698/gr10.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/187a883c52e0/fx1.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/4ef00b64a37e/gr1.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/11a398bb7a89/gr2.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/c05c2663c5bc/gr3.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/abfc1bc0213d/gr4.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/5d5d55a13be9/gr5.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/dc1cad3668a2/gr6.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/fb733fc35d1f/fx5.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/90441d2ef230/gr7.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/e7a692e02cf4/gr8.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/a4f0e1c58e1e/gr9.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/1d8a4c0af698/gr10.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/187a883c52e0/fx1.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/4ef00b64a37e/gr1.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/11a398bb7a89/gr2.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/c05c2663c5bc/gr3.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/abfc1bc0213d/gr4.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/5d5d55a13be9/gr5.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/dc1cad3668a2/gr6.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/fb733fc35d1f/fx5.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/90441d2ef230/gr7.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/e7a692e02cf4/gr8.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/a4f0e1c58e1e/gr9.jpg
https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7ec5/11697544/1d8a4c0af698/gr10.jpg

相似文献

1
Protocol for iterative enrichment of integrated sgRNAs via derivative CRISPR-Cas9 libraries from genomic DNA of sorted fixed cells.通过分选固定细胞基因组DNA的衍生CRISPR-Cas9文库对整合的sgRNA进行迭代富集的方案。
STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103493. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103493. Epub 2024 Dec 10.
2
Optimized protocol for gene editing in adipocytes using CRISPR-Cas9 technology.利用 CRISPR-Cas9 技术优化脂肪细胞中的基因编辑方案。
STAR Protoc. 2021 Jan 27;2(1):100307. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100307. eCollection 2021 Mar 19.
3
Protocol to identify receptors of secreted proteins through CRISPR-Cas9 whole-genome screening technology.通过CRISPR-Cas9全基因组筛选技术鉴定分泌蛋白受体的方案。
STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103315. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103315. Epub 2024 Sep 14.
4
Chemical-genetic CRISPR-Cas9 screens in human cells using a pathway-specific library.基于通路特异文库的人类细胞中化学遗传学 CRISPR-Cas9 筛选
STAR Protoc. 2021 Jul 28;2(3):100685. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100685. eCollection 2021 Sep 17.
5
Protocol for the saturation and multiplexing of genetic variants using CRISPR-Cas9.使用 CRISPR-Cas9 进行基因变异的饱和和多重扩增方案。
STAR Protoc. 2023 Dec 15;4(4):102702. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102702. Epub 2023 Nov 9.
6
Production and Validation of Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9 Delivery.用于CRISPR/Cas9递送的慢病毒载体的生产与验证
Methods Mol Biol. 2019;1961:93-109. doi: 10.1007/978-1-4939-9170-9_7.
7
Protocol for high-throughput screening of functional lysine residues in cell fitness.细胞适应性中功能性赖氨酸残基的高通量筛选方案
STAR Protoc. 2024 Dec 20;5(4):103418. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103418. Epub 2024 Oct 30.
8
Protocol for arrayed gRNA screening by base editors in mammalian cell lines using lentiviral system.基于慢病毒系统的哺乳动物细胞系中碱基编辑器的靶向 gRNA 筛选方案。
STAR Protoc. 2023 Dec 15;4(4):102668. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102668. Epub 2023 Nov 3.
9
CRISPR/Cas9 as a tool to dissect cancer mutations.CRISPR/Cas9 作为一种剖析癌症突变的工具。
Methods. 2019 Jul 15;164-165:36-48. doi: 10.1016/j.ymeth.2019.05.007. Epub 2019 May 10.
10
CRISPR deactivation in mammalian cells using photocleavable guide RNAs.利用光解向导 RNA 在哺乳动物细胞中进行 CRISPR 失活。
STAR Protoc. 2021 Oct 20;2(4):100909. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100909. eCollection 2021 Dec 17.

本文引用的文献

1
A genome-wide CRISPR/Cas9 screen identifies calreticulin as a selective repressor of ATF6α.全基因组 CRISPR/Cas9 筛选鉴定钙网织蛋白为 ATF6α 的选择性抑制剂。
Elife. 2024 Jul 29;13:RP96979. doi: 10.7554/eLife.96979.
2
The sound of silence: Transgene silencing in mammalian cell engineering.沉默的声音：哺乳动物细胞工程中的转基因沉默。
Cell Syst. 2022 Dec 21;13(12):950-973. doi: 10.1016/j.cels.2022.11.005.
3
Cargo receptor-assisted endoplasmic reticulum export of pathogenic α1-antitrypsin polymers.货物受体辅助病理性α1-抗胰蛋白酶聚合物的内质网输出。
Cell Rep. 2021 May 18;35(7):109144. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109144.
4
A genome-wide CRISPR screen identifies regulation factors of the TLR3 signalling pathway.全基因组 CRISPR 筛选鉴定 TLR3 信号通路的调控因子。
Innate Immun. 2020 Aug;26(6):459-472. doi: 10.1177/1753425920915507. Epub 2020 Apr 4.
5
Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets.Metascape 为系统水平数据集的分析提供了面向生物学家的资源。
Nat Commun. 2019 Apr 3;10(1):1523. doi: 10.1038/s41467-019-09234-6.
6
Targeted knock-in of an scFv-Fc antibody gene into the hprt locus of Chinese hamster ovary cells using CRISPR/Cas9 and CRIS-PITCh systems.使用CRISPR/Cas9和CRIS-PITCh系统将单链抗体片段-融合蛋白（scFv-Fc）抗体基因靶向敲入中国仓鼠卵巢细胞的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（hprt）基因座。
J Biosci Bioeng. 2018 May;125(5):599-605. doi: 10.1016/j.jbiosc.2017.12.003. Epub 2017 Dec 30.
7
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.全基因组规模的CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选。
Nat Protoc. 2017 Apr;12(4):828-863. doi: 10.1038/nprot.2017.016. Epub 2017 Mar 23.
8
Genetic dissection of mammalian ERAD through comparative haploid and CRISPR forward genetic screens.通过比较单倍体和 CRISPR 正向遗传筛选对哺乳动物 ERAD 的遗传剖析。
Nat Commun. 2016 Jun 10;7:11786. doi: 10.1038/ncomms11786.
9
Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.利用逆泊松分布通过高通量荧光成像系统计算感染复数和病毒复制情况。
Virol Sin. 2016 Apr;31(2):180-3. doi: 10.1007/s12250-015-3662-8.
10
Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.优化sgRNA设计以最大化CRISPR-Cas9的活性并最小化脱靶效应。
Nat Biotechnol. 2016 Feb;34(2):184-191. doi: 10.1038/nbt.3437. Epub 2016 Jan 18.