Université de Lorraine, CNRS, UMR 7365 Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA), F-54500, Nancy, France.
Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, F-91198, Gif-sur-Yvette cedex, France.
Sci Rep. 2018 Sep 14;8(1):13815. doi: 10.1038/s41598-018-32164-0.
Archaeal RNA:pseudouridine-synthase (PUS) Cbf5 in complex with proteins L7Ae, Nop10 and Gar1, and guide box H/ACA sRNAs forms ribonucleoprotein (RNP) catalysts that insure the conversion of uridines into pseudouridines (Ψs) in ribosomal RNAs (rRNAs). Nonetheless, in the absence of guide RNA, Cbf5 catalyzes the in vitro formation of Ψ in Pyrococcus abyssi 23S rRNA and of Ψ in tRNAs. Using gene-disrupted strains of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis, we studied the in vivo contribution of proteins Nop10 and Gar1 to the dual RNA guide-dependent and RNA-independent activities of Cbf5 on 23S rRNA. The single-null mutants of the cbf5, nop10, and gar1 genes are viable, but display a thermosensitive slow growth phenotype. We also generated a single-null mutant of the gene encoding Pus10, which has redundant activity with Cbf5 for in vitro formation of Ψ in tRNA. Analysis of the presence of Ψs within the rRNA peptidyl transferase center (PTC) of the mutants demonstrated that Cbf5 but not Pus10 is required for rRNA modification. Our data reveal that, in contrast to Nop10, Gar1 is crucial for in vivo and in vitro RNA guide-independent formation of Ψ (Ψ in P. abyssi) by Cbf5. Furthermore, our data indicate that pseudouridylation at orphan position 2589 (2585 in P. abyssi), for which no PUS or guide sRNA has been identified so far, relies on RNA- and Gar1-dependent activity of Cbf5.
古菌 RNA：假尿嘧啶核苷合成酶 (PUS) Cbf5 与蛋白质 L7Ae、Nop10 和 Gar1 以及引导盒 H/ACA sRNA 形成核糖核蛋白 (RNP) 催化剂，可确保核糖体 RNA(rRNA) 中尿嘧啶转化为假尿嘧啶 (Ψs)。然而，在没有引导 RNA 的情况下，Cbf5 可催化 Pyrococcus abyssi 23S rRNA 中 Ψ 的体外形成和 tRNA 中 Ψ 的体外形成。我们使用嗜热古菌 Thermococcus kodakarensis 的基因缺失菌株研究了蛋白质 Nop10 和 Gar1 在 Cbf5 对 23S rRNA 的双重 RNA 引导依赖性和非依赖性活性的体内贡献。cbf5、nop10 和 gar1 基因的单缺失突变体是可行的，但表现出热敏感的缓慢生长表型。我们还生成了编码 Pus10 的基因的单缺失突变体，该基因在体外形成 tRNA 中的 Ψ 方面与 Cbf5 具有冗余活性。对突变体 rRNA 肽基转移酶中心 (PTC) 中 Ψs 的存在进行分析表明，Cbf5 而不是 Pus10 是 rRNA 修饰所必需的。我们的数据表明，与 Nop10 相反，Gar1 对于 Cbf5 的体内和体外非 RNA 引导依赖的 Ψ（P. abyssi 中的 Ψ）形成至关重要。此外，我们的数据表明，迄今为止尚未鉴定出 PUS 或引导 sRNA 的孤儿位置 2589（P. abyssi 中的 2585）的假尿嘧啶化依赖于 Cbf5 的 RNA 和 Gar1 依赖性活性。
