Department of Microbiology and Cell Biology, Indian Institute of Science, Bangalore 560012, India.
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology 125 Gwahak-ro,Yuseong-gu, Daejeon 34141, Republic of Korea.
Nucleic Acids Res. 2023 Jul 21;51(13):6554-6565. doi: 10.1093/nar/gkad486.
UdgX excises uracil from uracil-containing DNA to concurrently form a covalent bond with the resulting AP-DNA. Structurally, UdgX is highly similar to family-4 UDGs (F4-UDGs). However, UdgX is unique in possessing a flexible R-loop (105KRRIH109). Among the class-defining motifs, while its motif A (51GEQPG55) diverged to possess Q53 in place of A53/G53 in F4-UDGs, motif B [178HPS(S/A)(L/V)(L/V)R184] has remained unchanged. Previously, we proposed an SN1 mechanism resulting in a covalent bond between H109 and AP-DNA. In this study, we investigated several single/double mutants of UdgX. The H109A, H109S, H109G, H109Q, H109C and H109K mutants gain conventional UDG activity to varying levels. The crystal structures of UdgX mutants show topological changes in their active sites, rationalizing their UDG activities. The E52Q, E52N and E52A mutants reveal that E52 forms a catalytic dyad with H109 to enhance its nucleophilicity. The Q53A mutant supports that UdgX specific evolution of Q53 occurred essentially to stabilize the R-loop conformation. The R184A mutation (motif B) supports the role of R184 in substrate-binding. Taken together, the structural, bioinformatics, and mutational studies suggest that UdgX diverged from F4-UDGs, and the emergence of the characteristic R-loop in UdgX is functionally assisted by A53/G53 to Q53 changes in motif A.
UdgX 从含有尿嘧啶的 DNA 中切除尿嘧啶，同时与产生的 AP-DNA 形成共价键。在结构上，UdgX 与家族 4 UDGs（F4-UDGs）非常相似。然而，UdgX 独特之处在于它具有一个灵活的 R 环（105KRRIH109）。在类定义基序中，虽然它的基序 A（51GEQPG55）发生了分歧，在 F4-UDGs 中取代了 A53/G53 位的 Q53，但基序 B [178HPS（S/A）（L/V）（L/V）R184] 保持不变。以前，我们提出了一个 SN1 机制，导致 H109 和 AP-DNA 之间形成共价键。在这项研究中，我们研究了 UdgX 的几个单/双突变体。H109A、H109S、H109G、H109Q、H109C 和 H109K 突变体获得了不同程度的常规 UDG 活性。UdgX 突变体的晶体结构显示其活性部位的拓扑结构发生了变化，这解释了它们的 UDG 活性。E52Q、E52N 和 E52A 突变体表明 E52 与 H109 形成催化二联体，增强了其亲核性。Q53A 突变体支持 UdgX 中 Q53 的特定进化基本上是为了稳定 R 环构象。R184A 突变（基序 B）支持 R184 在底物结合中的作用。总之，结构、生物信息学和突变研究表明，UdgX 从 F4-UDGs 中分化出来，而特征性 R 环的出现在功能上得到了 A53/G53 向 Q53 变化的辅助。
