使用 DMS 和 CMCT 的化学探测方法研究 RNA 二级结构。

RNA Secondary Structure Study by Chemical Probing Methods Using DMS and CMCT.

机构信息

Université de Strasbourg-Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, "Architecture et Réactivité de l'ARN" CNRS UPR9002, Strasbourg, France.

出版信息

Methods Mol Biol. 2021;2300:241-250. doi: 10.1007/978-1-0716-1386-3_18.

DOI:10.1007/978-1-0716-1386-3_18

PMID:33792883

Abstract

RNA folds into secondary structures that can serve in understanding various RNA functions (Weeks KM. Curr Opin Struct Biol 20(3):295-304, 2010). Chemical probing is a method that enables the characterization of RNA secondary structures using chemical reagents that specifically modify RNA nucleotides that are located in single-stranded areas. In our protocol, we used Dimethyl Sulfate (DMS) and Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl) Carbodiimide metho-p-Toluene sulfonate (CMCT) that are both base-specific modifying reagents (Behm-Ansmant I, et al. J Nucleic Acids 2011:408053, 2011). These modifications are mapped by primer extension arrests using 5' fluorescently labeled primers. In this protocol, we show a comprehensive method to identify RNA secondary structures in vitro using fluorescently labeled oligos. To demonstrate the efficiency of the method, we give an example of a structure we have designed which corresponds to a part of the 5'-UTR regulatory element called Translation Inhibitory Element (TIE) from Hox a3 mRNA (Xue S, et al. Nature 517(7532):33-38, 2015).

摘要

RNA 折叠成二级结构，可以帮助理解各种 RNA 功能（Weeks KM。Curr Opin Struct Biol 20(3):295-304, 2010）。化学探测是一种利用化学试剂来表征 RNA 二级结构的方法，这些化学试剂专门修饰位于单链区域的 RNA 核苷酸。在我们的方案中，我们使用了二甲磺酸（DMS）和环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲磺酸酯（CMCT），它们都是碱基特异性修饰试剂（Behm-Ansmant I，等。J 核酸 2011:408053, 2011）。这些修饰通过使用 5'荧光标记引物的引物延伸阻滞来进行定位。在这个方案中，我们展示了一种使用荧光标记寡核苷酸在体外识别 RNA 二级结构的综合方法。为了证明该方法的效率，我们给出了一个我们设计的结构的例子，该结构对应于 Hox a3 mRNA 的 5'-UTR 调节元件的一部分，称为翻译抑制元件（TIE）（Xue S，等。自然 517(7532):33-38, 2015）。